肥厚型心肌病患者如果存在心室流出道梗阻，通常具有特征性的临床表现，因此诊断相对较容易。超声心动图检查是诊断肥厚型心肌病的重要无创性工具。通过超声心动图检查，可以发现室间隔厚度大于或等于18厘米，并且有二尖瓣在收缩期之前移位，这些特征足以区分梗阻性和非梗阻性的患者。一些患者可能在临床上没有明显症状，但经过超声心动图检查后，就可以提示存在肥厚型心肌病的可能性。而左心导管检查和心室造影可以用来进一步证实诊断。

如果在临床上发现胸骨下段左缘有收缩期前杂音，怀疑是梗阻型肥厚型心肌病时，可以通过改变左室流出道的压力差来观察杂音的变化以帮助诊断。具体的方法包括使用含化硝酸甘油的药物、吸入亚硝酸异戊酯，滴入异丙肾上腺素，或采取Valsalva动作，并观察心肌收缩力加强或减弱时左室流出道梗阻的变化。

然而，肥厚型心肌病尤其是梗阻型的确诊，仍然需要与室间隔缺损、主动脉瓣狭窄、风湿性二尖瓣关闭不全、冠心病等其他疾病进行鉴别诊断。近年来，随着心脏超声技术的进步，药物试验的方法已经得到了很大的改善。