系统性红斑狼疮患者血清dna酶测定的临床意义

中华皮肤科杂志1998年第6期第31卷论著

作者：曾凡钦陈宜芳李伯有林宝珠许德清

单位：510120广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院皮肤科

关键词：红斑狼疮；系统性；脱氧核糖核酸酶类

【摘要】目的研究血清dna酶(dnase)浓度异常在系统性红斑狼疮(sle)发生发展中所起的作用。方法于国内首次用单相酶扩散法检测了63例sle患者。结果患者血清中dnase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；sle伴肾损害患者低于非肾损害患者。血清dnase的浓度下降与dna含量升高呈负相关；与血沉、ana呈负相关；与补体c3、c4呈正相关；与病情活动积分呈负相关。结论sle患者由于其dnase水平低下，使得血循环中含dna的自身抗原长期滞留，发挥免疫原性，并与抗dna抗体结合形成免疫复合物，造成免疫损伤。患者血清dnase水平低下在sle的发病机制中起着一定作用。

themeasurementofdeoxyribonucleaseanditsclinicalsignificanceinpatientswithslezengfanqin,chenyifang,liboyou,etal.departmentofdermatology,sunyatsenmemorialhospital,sunyatsenuniversityofmedicalsciences,guangzhou510120

【abstract】objectivetostudytheroleofabnormalconcentrationofdnaseinthedevelopmentofsle.methodstheconcentrationofdnasewasmeasuredbysingleradialenzymediffusionmethodintheseraof63slepatients.resultstheconcentrationofdnaseinthepatientswassignificantlylowerthanthatinhealthyindividuals,significantlylowerinpatientsatactivestagethanthatinremission,andlowestinpatientswithlupusnephritis.thedecreaseofserumdnasewasnegativelycorrelatedwiththeincreaseofserumdna.thelevelofdnasewasnegativelycorrelatedwithanaandesr,positivelycorrelatedwithc3,c4,andnegativelycorrelatedwiththeseverityofthedisease.conclusiontheabovedatasuggestthatthedecreaseofserumdnasemakesthepersistenceofdnainthebloodcirculationwhichcombineswithantidnaantibodytoformimmunecomplex,resultinginautoimmunelesions.thedecreaseofserumdnasemayplayanimportantroleinthepathogenesisfsle.

【keywords】lupuserythematosus,systemicdeoxyribonucleases

已经证实系统性红斑狼疮(sle)患者血循环中dna水平升高[1～3]，但其升高的原因尚不清楚，有可能是因为dna清除机制的缺陷[4]。我们用单相酶扩散法检测sle患者血清dna酶(dnase)的浓度，并探讨血清dnase浓度异常与dna升高的关系以及在sle发生发展中所起的作用。

材料与方法

1.主要试剂：三羟甲基氨基甲烷(tris)、牛胸腺dna、牛胰dna酶ⅰ(dnase)、rna酶a(rnase)：fluka公司和sigma公司产品；溴化乙啶(ethidiumbromide,eb)、琼脂糖：华美生物工程公司产品。

2.仪器：荧光分光光度计：f-2000型，日本hitachi公司产品；紫外透射仪：wp-1型，永嘉上塘教学仪器厂。

3.检测对象：sle患者63例，男6例，女57例，全部为我科1997年9月至1998年3月的住院及门诊患者。所有患者均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。参照文献[5]，患者按临床症状及实验室检查评定病情活动积分，并分类为活动期患者和缓解期患者、伴肾损患者和非肾损患者。

4.正常对照组：为我市中心血站的健康献血员38例，性别及年龄均与患者组相匹配。

5.dnase的测定(单相酶扩散法)：用ph7.2005mol/ltrishcl缓冲液配1％的琼脂糖凝胶20ml，其中含牛胸腺dna和eb分别为6mg和0.5mg，灌制凝胶板，用直径为1.5mm的打孔器于凝胶板上打孔。加入4μl样本(标准dna或待检血清)，37℃湿盒孵育16小时，0.1mol/l的edta终止反应，于紫外透射仪下观察并测量dna水解环的大小。在一定范围内，水解环的大小与dnase的浓度成正比。

6.血清dna含量的测定：取血清0.1ml，加ph7.202mol/ltrishcl缓冲液0.7ml、rnase(1mg/ml)0.2ml，37℃水浴30分钟，加eb工作液(20μg/ml)1ml，用荧光分光光度计测定荧光强度。

7.其他观察指标：ana：间接免疫荧光法，抗dna抗体：金标免疫斑点法，补体c3及c4：免疫化学比浊法，beckmanarray360蛋白分析仪。以上检查全部为我科的常规临床检验项目。

结果

1.dnase标准品的测定：将牛胰dnase分别稀释成10、20、30、40、50、60ng/ml，测量dna水解环的大小(图1)，以dnase的浓度为横坐标、水解环的直径为纵坐标绘制标准曲线，未知标本可根据其水解环的大小从标准曲线上查得其dnase的浓度。

1～6：dnase标准浓度：60、50、40、30、20、10ng/ml

图1dnase的浓度测定（单相酶扩散法）

2.sle患者血清中dnase浓度的测定：共检测了正常人血清38份，sle患者血清63份，其中活动期患者35例，缓解期患者28例，伴肾损害患者21例。结果见附表。sle患者血清中dnase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；伴肾损害患者明显低于非肾损害患者。

3.sle患者的血清dnase浓度与dna含量的相关性：63份患者血清用荧光分光光度法检测其dna含量，结果35例活动期患者的血清dna含量为(33～150)μg/ml(92.06±20.32)，28例缓解期患者的血清dna含量为31～90μg/ml(57.18±16.13)，相关分析发现，不论在活动期还是缓解期，血清dnase的浓度都与dna含量呈负相关(活动期：r=－0.754，p＜0.01；缓解期：r=－0.827，p＜0.01)。

4.sle患者的血清dnase与ana、抗dna抗体、补体、血沉等的相关性：将sle患者的血清dnase浓度与ana、抗dna抗体、补体、血沉等作直线相关分析，结果为dnase的浓度与血沉、ana呈负相关(r分别为－0.701、－0.416，p值均＜0.01)；与c3、c4呈正相关(r分别为0.469、0.438，p值均＜0.01)；与抗dsdna抗体无相关性(r为0.217，p＞0.05)。

5.sle患者的血清dnase水平与病情积分的相关性：直线相关分析表明，患者的血清dnase水平与病情积分呈高度负相关(r为－0.884，p＜0.01)。

讨论

sle的发病机理尚不完全清楚，大量研究表明dna抗dna免疫复合物在sle的发病以及器官损害中起着重要作用[1，2，6]，患者血中的dna含量比正常人高，并随病情的活动与缓解而波动，说明患者的确存在dna的代谢异常。机体清除dna的途径主要是通过dnase的降解作用。我们同时检测了63例sle患者的血清dna与dnase，发现患者的dnase浓度低于正常人，活动期患者dnase浓度低下更为明显；dnase低下的程度与dna水平升高的程度呈负相关，提示dnase活性不足是造成血中dna升高以及sle发病的重要因素之一。国外学者检测了nzb/wf1狼疮鼠血清中的dnase，发现其浓度明显低于同样性别和年龄的正常小鼠，更有意义的是小鼠先有dnase的低下(5～10周)，然后才有抗dna抗体的产生(12～16周)[4]。本文实验发现，伴有肾损害的患者dnase浓度明显低于非肾损害，在63例患者中，血清dnase浓度最低的5例(2～8ng/ml)患者全部为伴肾损害的活动期患者；提示dnase的低下在sle肾损害中起着重要作用。

在正常机体中，因衰老或因发生感染、炎症等，都可释放dna到血中，这些dna可迅速被循环中的dnase降解[7]，其半衰期仅约4分钟。在sle患者，因其血中dnase活性低于正常水平，不能有效地处理急剧增加的dna，于是多量的dna在体内滞留。总结本文结果并综合文献复习，我们得出以下推理：sle患者体内dnase活性低下，不能充分行使其水解dna的作用，使得血循环中含dna的自身抗原长期滞留，于是发挥免疫原性，并与抗dna抗体结合形成免疫复合物，随血循环沉积于肾脏等组织器官，造成多系统免疫损伤。测定患者dnase活性在研究sle复杂的免疫发病机制上具有一定意义。

参考文献

1mccoubreyhoyera,okarmatb,holmanhr.partialpurificationandcharacterizationofplasmadnaanditsrelationtodiseaseactivityinsystemiclupuserythematosus.amjmed,1984,77∶23-34.

2rumorepm,steinmancr.endogenouscirculatingdnainsystemiclupuserythematosus:occurrenceasmultimericcomplexesboundtohistone.clininvest,1990,86∶69-74.

3morimotoc,sanoh,abet,etal.correlationbetweenclinicalactivityofsleandtheamountsofdnaindna/antidnaantibodyimmunecomplexes.jimmunol,1982,139∶1960.

4macanovicm,lachmannpj.measurementofdeoxyribonucleaseintheserumandurineofsystemlupuserythemoatosuspronenzb/wmicebyanewradialenzymediffusionassay.clinexpimmunol,1997,108∶220-226.

5许蓓红,许德清,谢彦博.sle患者bpmc表面的dna受体及其临床意义.中华皮肤科杂志,1991,24∶228-231.

6kalsijk,suttonb.structuralanalysisofantidnaantibodies.lupus,1997,6∶317-320.

7emlenw,mannikm.kineticsandmechanismsforremovalofcirculatingsinglestrandeddnainmice.jexpmed,1978,147∶684-699.

(收稿：1998-04-13修回：1998-06-22)