诊断困难，必须与细菌性角膜溃疡相鉴别。农业眼外伤史，典型的临床表现，是诊断的主要依据。此外，当怀疑真菌感染时，应在角膜病变处进行刮除。将去除的坏死组织放在载玻片上，滴一滴5%的氢氧化钾，盖住碎片，立即用显微镜检查，寻找真菌菌丝。有条件时应进行真菌培养。

1.刮刀检查

(1)取材:表面麻醉后(最好涂0.5%丙氧芬卡因，因其抑菌作用较其他表面麻醉剂轻)，用圆形刀片从病灶深处或边缘刮取组织。

(2)染色方法:常用革兰氏染色法、姬姆萨染色法和KOH湿染法，有时也可用Gomorimefhenamine染色法。染色阳性率分别为55%、66%、33%和85%。革兰氏染色是最简单的。真菌为革兰氏阳性(深紫色)，其他组织为阴性(红色)。湿切片法用KOH溶解刮除法中的非真菌杂质，以显示菌丝。据报道，同时加入亮绿、次甲基绿或墨水染色(10%氢氧化钾与墨水按9∶1的比例混合)可增加对比度。光镜下可见真菌细胞壁上附着墨汁或绿色小颗粒，胶原纤维和炎性细胞未染色。对比强烈，容易识别。缺点是容易出现假阳性或假阴性。最近，卡氏荧光-白色染色(CFW染色)已被使用。这种染色剂能与真菌细胞壁中的几丁质和纤维素紧密结合，在荧光显微镜下真菌呈现强烈的深绿色。

2.真菌培养医生刀片检查简单快速，但只能确定是真菌，不能鉴定真菌菌株，不能进行药敏试验。因此，还必须进行真菌培养。常见的培养方法和温度如下。

(1)血琼脂，在25℃和37℃培养。

(2)沙氏葡萄糖琼脂，25℃和37℃培养。

(3)马铃薯葡萄糖琼脂，25℃和37℃培养。

大多数酵母菌在血琼脂中容易生长，丝状菌在沙氏琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂中容易生长(注意镰孢菌在37℃下2 ~ 3天即可生长，其他真菌在37℃下生长需要1周以上)。

3.国外已采用聚合酶链反应(PCR)对临床分离的真菌进行体外培养，认为PCR用于角膜真菌的快速诊断具有良好的应用前景，但需要解决假阳性结果的问题。

4.几丁质灯对真菌的鉴定(1995)指出，几丁质是真菌和节肢动物中含有的多糖结构，哺乳动物中缺乏。真菌细胞壁的几丁质成分因菌株不同而不同，因此具有很高的特异性。具有不同荧光标记的凝集素能与不同的几丁质特异性结合，发出特异性荧光，从而快速诊断和鉴定菌株。目前，该技术在国外被认为是一种快速、特异的真菌诊断方法，但在国内尚未见报道。

1.角膜活检。当刮片和培养均为阴性结果时，除了反复检查外，临床上仍怀疑真菌感染时，也应做角膜活检。用尖刀切开病灶组织或用穿透性角膜移植术钻孔，然后用石蜡固定，再制成病理切片，然后染色镜检。光镜染色方法有PAS染色、HE染色、抗酸染色等。荧光显微镜显示吖啶橙染色和CFW染色。组织观察:

(1)“菌丝包被”由大量中性粒细胞浸润、角膜基质凝固坏死和胶原纤维肿胀组成，很少见到完整的真菌。

(2)菌丝包被的病灶周围有大量菌丝。菌丝沿角膜板层平行扩散，也可垂直穿透角膜板层前后生长，通过后弹力膜到达前房或后房，引起炎症反应。

(3)“羽状缘”是圆形细胞和浆细胞的浸润，不是真菌的菌丝。

2.共焦显微镜共焦显微镜是20世纪90年代中期发展起来的一种新的角膜疾病无创检查方法，可以在细胞水平上观察角膜的不同层次。已应用于HSK和棘阿米巴角膜炎的诊断。Winchester(1997)用共聚焦显微镜观察了曲霉菌角膜炎。角膜内发现直径6m、长60 ~ 40m的高清晰菌丝。共聚焦显微镜在时间、灵敏度和安全性上明显优于以往任何一种诊断方法。