应与慢性化脓性骨髓炎、尤文氏肉瘤、转移性骨肿瘤相鉴别。

慢性化脓性骨髓炎:髓腔弥漫性密度增高，皮质增厚，但无大块骨质破坏或瘤骨形成，软组织肿胀不明显。如果死骨存在，骨髓炎的诊断更明确。

尤文氏肉瘤:表现为髓腔内点状和鼠咬状溶骨性破坏，范围长，并有洋葱皮样骨膜反应。

转移性肿瘤:很少侵犯膝关节附近的骨骼，常见于骨盆和脊柱。骨质改变多为溶骨性，多无骨膜反应和软组织肿块。

在诊断骨肉瘤时，应排除其他肿瘤，如成骨细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤和转移性骨肿瘤。骨干上的骨肉瘤有时与尤文肉瘤相混淆。其他疾病如布罗迪脓肿、骨髓炎、骨结核甚至骨痂有时会被误诊为骨肉瘤。术前临床表现结合影像学检查和穿刺活检是必要的鉴别诊断方法。